Étudiants Gradués et au Post-doctorat Détails: Kim Doré, Étudiante au Post-doctorat
Website: www.greenspine.ca
Sujet : Étude d’interactions protéiques aux synapses par imagerie de temps de vie de fluorescence (FLIM) et développement d’un microscope basé sur la déplétion stimulée (Stimulated emission depletion, STED) afin d’obtenir une résolution spatiale améliorée.
La protéine kinase Ca2+-calmoduline dépendante II (CaMKII) est une des protéines les plus abondantes dans les régions post-synaptiques des neurones excitateurs. Nous étudions les interactions entre la CaMKII et les récepteurs au glutamate (comme le récepteur NMDA) car de nombreuses études suggèrent que ces interactions auraient un rôle important dans la plasticité synaptique, impliquée dans les processus de mémoire et d’apprentissage. En marquant les protéines d’intérêt avec des protéines fluorescentes et en exprimant ces constructions dans les neurones par transfert de gène, il est possible d’étudier leurs interactions en utilisant le transfert d’énergie résonnant (Fluorescence resonance energy transfert, FRET). Pour quantifier le niveau de FRET dans les neurones, nous mesurons le temps de vie de fluorescence du fluorophore donneur. Par exemple, en utilisant des neurones exprimant la CaMKII marquée avec mCherry et des récepteurs NMDA marqués avec GFP, nous observons que le temps vie de GFP est significativement réduit suite à une stimulation des récepteurs NMDA; ceci indiquant une interaction entre le récepteur NMDA et la CaMKII. Toutefois, la résolution spatiale de la microscopie optique est limitée à environ 200 nm, ce qui est nettement insuffisant pour l'étude d’interactions moléculaires de l’ordre du nanomètre à l'intérieur d’épines micrométriques. En intégrant à notre microscope FLIM une nouvelle technique, la déplétion stimulée (STED), qui peut améliorer la résolution optique de la microscopie de fluorescence jusqu’à 20-70 nm, nous serons en mesure d'effectuer la localisation ultrastructurale des protéines étudiées, ainsi que de leurs interactions, dans les cellules vivantes.
Imagerie de temps de vie de fluorescence de neurones d’hippocampe exprimant les constructions GFP-NR1 (sous-unité du récepteur NMDA) et mCherry-CaMKII. Le code de couleur indique le temps de vie de GFP, les régions de couleur rouge sont celles ou l’interaction entre le récepteur NMDA et la CaMKII sont maximales. A) Neurones non-stimulées B) Neurones stimulées 1 minute avec une solution activant les récepteurs NMDA, contenant du glutamate et de la glycine. |
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